間接法原理
樣品中待測抗體與固相抗原結(jié)合后，使用酶標(biāo)記和抗體（抗人Ig）進(jìn)行檢測。
一種測定抗體的簡易ELISA方法。病原體或其他外來大分子進(jìn)入人體后會刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此可以通過檢測某種病原體的相應(yīng)抗體來確定機(jī)體是否已被某種病原體感染，從而達(dá)到診斷的目的。
間接法是測定抗體最常用的方法。在這種方法中，已知的定量抗原（例如病原體的蛋白質(zhì)）首先被固體載體吸附（也稱為涂層）（在微孔滴定板的微孔中），然后添加到待測樣品中（如果患者的血清中含有相應(yīng)的抗體，則為*抗體）并與其結(jié)合。孵育反應(yīng)時(shí)間。此時(shí)，如果血清中含有針對病原體蛋白的抗體（*抗體），則抗體將與固相抗原特異性結(jié)合，然后添加酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體（第二抗體是酶標(biāo)記的抗體，如果血清是人血清，則將抗體添加到抗人抗體）。酶標(biāo)記的抗抗體將與與已知固相抗原結(jié)合的*抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)記的第二抗體復(fù)合物，經(jīng)過相同的保溫和洗滌后，加入無色酶底物，保持一定時(shí)間進(jìn)行酶反應(yīng)，酶催化底物顯色。觀察反應(yīng)后的顏色，判斷反應(yīng)結(jié)果。如果有顯色反應(yīng)，則表示測試樣品含有相應(yīng)的抗體，因此為陽性反應(yīng)。也可以根據(jù)顏色深度進(jìn)行定量分析。相反，如果它是無色的，則意味著樣品中沒有相應(yīng)的抗體，這是一種負(fù)反應(yīng)。
間接法操作步驟
1、包衣固體載體：用已知抗原包衣固體，形成固體抗原，洗滌除去未結(jié)合抗原和雜質(zhì)；
2.阻斷：用高濃度無關(guān)蛋白阻斷，以防止待測血清中非特異性IgG的固相吸附；
3.加入待測樣品：孵育（37℃，2h）后，將相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合。清洗以去除無關(guān)物質(zhì)；
4.添加酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)SPA：再次孵育（37℃，2h），使酶標(biāo)抗與固相載體上的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌以除去未偶聯(lián)酶標(biāo)記的抗抗體；
5.底物顯色：孵育（37℃，30min）；
6.終止反應(yīng)的測定結(jié)果應(yīng)通過目測定性確定，或通過使用微孔板讀數(shù)器進(jìn)行光密度測量進(jìn)行定量分析。
間接法的方法評價(jià)
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是檢測抗體最常用的方法，應(yīng)用廣泛，靈敏度高。酶標(biāo)記抗體的應(yīng)用可用于檢測物種中各種抗原的相應(yīng)抗體。
間接法的應(yīng)用
間接ELISA主要用于檢測抗體。該方法可用于檢測：人類免疫缺陷病毒HIV（-1/2）抗體、丙型肝炎病毒抗體（抗-HCV）、戊型肝炎抗體（抗HEV）、庚型肝炎病毒（抗-HGV）等
丙型肝炎病毒檢測適應(yīng)癥：用于檢測血清或血漿中的丙型肝炎抗體，用于獻(xiàn)血員篩查機(jī)的臨床輔助診斷。原理如下：將HCV結(jié)構(gòu)區(qū)核心蛋白和非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白的混合抗原涂布在微帶上，將樣品加入固相抗原板。當(dāng)樣品中含有HCV特異性抗體（*抗體）時(shí)，抗體將特異性結(jié)合固相抗原，然后加入過氧化物酶標(biāo)記的抗人（IgG），抗體將特異性結(jié)合固相抗原，酶標(biāo)記抗體將與固相抗原結(jié)合的*抗體結(jié)合形成抗原-抗體-酶標(biāo)記的第二抗體復(fù)合物，然后加入底物催化