類風(fēng)濕因子檢測
類風(fēng)濕因子（RF）是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和其他疾病患者血清中的一種自身抗體。RF與變性IgG的Fc片段結(jié)合形成免疫復(fù)合物并沉積在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，激活補體并引起免疫病理損傷。
道德原則
將純化的兔IgG涂布在微孔板上。加入稀釋的待測血清后，如果血清中有RF，它與兔IgG形成復(fù)合物，與辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgM抗體結(jié)合。洗滌后，加入鄰苯二胺顯色。反應(yīng)結(jié)束后，確定每個反應(yīng)孔的A492值。從標準曲線中可以找到對應(yīng)于樣品吸光度值的血清IgM型RF濃度。
材料
抗原：兔IgG
微孔板
Parafilm公司
涂層緩沖液：碳酸鹽緩沖液（50nmol/L，PH9.6）
包衣液：將兔IgG溶解在包衣緩沖液中，使最終濃度為100mg/L
洗滌液/稀釋劑：含有0.05%吐溫20的磷酸緩沖液（PBST）
密封溶液：含10%牛血清白蛋白的碳酸鹽緩沖液（100g/L）
酶標記二級抗體：辣根過氧化物酶標記山羊抗人IgM
底物：鄰苯二胺（OPD）
終止溶液：2mol/L H2SO4
待測血清的預(yù)處理：待測血清在56℃水浴中孵育30分鐘，使補體失活
水浴箱
微板閱讀器
操作步驟
1.在微孔板μL涂布液的測試孔中加入50，在37℃過夜時，在涂有緩沖液、密封膜和板的μL對照孔中僅加入50%。
2.PBST應(yīng)至少清洗三次，每次3min。最后一次清洗后，應(yīng)將孔內(nèi)殘留的清洗液倒置干燥。
3.每孔加入50μL密封溶液，37℃孵育1h。
4.同步步驟2中的清洗。
5.滅*清按1:10稀釋，然后按1:4連續(xù)稀釋5次，使血清稀釋度從1:10至1:10 240。
6.在每個孔中加入50份稀釋血清，μl，在4℃下孵育3h。
7.同步步驟2中的清洗。
8.每孔加入50μ。
9.同步步驟2中的清洗。
10.底物制備：將20mg OPD溶于pH 5.0的20ml檸檬酸緩沖液中，然后8μL30%H2O2，混合均勻。
11.每孔添加50μL。將底物在37℃黑暗中孵育30分鐘。
12.每孔添加50μL停止溶液，用微孔板讀數(shù)器測量A492值。
結(jié)果分析
同時，各反應(yīng)板用參比血清按上述方法制作標準曲線。
通過每個樣品的A值，可以從標準曲線中找到相應(yīng)的血清RF濃度。
注意事項
1.兔IgG作為抗原與人IgG Fc片段作為抗原的檢測結(jié)果無顯著性差異。
2.加入終止溶液后，輕敲微孔板以確保均勻混合。
3.每個實驗都需要陽性和陰性對照。